Ин витро

Ин витро процесът представлява изкуствено оплождане на яйцеклетката в контролирани и лабораторни условия.

Методът е разработен от британския учен Робърт Едуардс, а първото бебе, заченато чрез ин витро, се казва Луиз Браун и се ражда на 25 юли 1978 година. За постижението си и предоставянето на възможност и шанс на милиони бездетни двойки по света да имат собствени деца, Робърт Едуардс получава Нобелова награда за медицина през 2010 година.

Показания

Меотдът ин витро може да бъде използван за преодоляване на безплодие при жената, причинено например от непроходимост на маточните тръби или безплодие с мъжки фактор, поради намален брой и/или намалена подвижност на сперматозоидите. При мъжки стерилитет може бъде използван и методът ИКСИ /интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоид/. При него избран сперматозоид бива инжектиран директно в яйцеклетката. Възможно е да се използват и донорски яйцеклетки и сперматозоиди.

Метод

Теоретично ин витро оплождане може да се осъществи чрез получаване на яйцеклетка при естествена овулация. На практика обаче без прилагането на допълнителни техники шансовете за успешна бременност са изключително малки. Сред техниките, които често се използват при асистираната репродукция, са: овариална (яйчникова) хиперстимулация за получаване на множество яйцеклетки, трансвагинална пункция на фоликулите под ултразвуков контрол, подготовка на яйцеклетките и сперматозоидите, както и отглеждане и подбор на получените ембриони.

Контролирана овариална хиперстимулация

Обикновено стимулацията на яйчниците започва на третия ден от менструалния цикъл и се състои в приемането на медикаменти с цел развитие на множество фоликули в яйчниците. Преди да се премине към стимулация обаче се проверява нивото на яйчниковия запас. Ако той е изчерпан или силно редуциран, процедурата не се извършва и по желание на пациента се преминава към вариант, в който се използват донорски яйцеклетки. Наблюдението включва често (понякога ежедневно) измерване на нивата на естрадиол в кръвта и на растежа на фоликулите посредством трансвагинална ултрасонография. Обикновено са необходими инжекции, които се поставят в продължение на 10 дни.

Получаване на яйцеклетки

Когато нарастването на фоликулите се оцени като достатъчно, се пристъпва към стимулиране на финалното им съзряване чрез медикаменти. Те обикновено довеждат до разпукването на фоликулите /т.е. овулация/ около 42 часа след прилагането им. Процедурата /наречена пункция/ се извършва под обща или локална анестезия на пациентката и отнема 15-20 минути.

Подготовка на яйцеклетките и сперматозоидите

В лабораторията яйцеклетките се почистват от заобикалящите соматични и други клетки и вещества и се подготвят за оплождане. Междувременно сперматозоидите също се подготвят чрез пречистване от неподвижните и негодни клетки.

Оплождане

Яйцеклетките и сперматозоидите се инкубират заедно в съотношение 1:75 000 за около 18 часа. В повечето случаи през това време яйцеклетките се оплождат и започват да се делят. Когато количеството или качеството на получените сперматозоиди не е достатъчно, може да се използва т.нар. ИКСИ – избира се един добре развит, подвижен и с правилна морфология (форма) сперматозоид, който се инжектира директно в цитоплазмата на яйцеклетката. Оплодените яйцеклетки (зиготи) се прехвърлят в хранителна среда и се оставят в нея за около 48 часа.

Отглеждане на ембрионите

Ембрионите се отглеждат, докато достигнат 6-8 клетъчен стадий (около 3 дни след пункцията) в специална хранителната среда, съдържаща глюкоза и други енергийни компоненти, като аминокиселини, нуклеотиди, витамини. В някои случаи отглеждането продължава до фаза морула (12-32 клетки) или бластоцист, т.е. 3-4 дни след оплождането, съответно 4-5 дни след пункцията.

Подбор на ембрионите

Яйцеклетки и ембрионите биват оценени по предварително определени и приети методи с цел оптмизиране процента на успеваемост. Методите за оценяване могат да включват морфологични, имунологични и генетични показатели, по които да се преценят най-добрите ембриони, които биха довели до успешна бременност.

Трансфер на ембрионите

Зародишите се разглеждат и оценяват от ембриолозите на база брой на клетките, равномерно нарастване и фаза на делене. Броят за трансфер зависи от наличните ембриони, възрастта на жената и други здравни и диагностични показатели. За да се увеличи шансът за успешна бременност, обикновено се прехвърлят няколко ембриона. Най-често този брой обаче е ограничен до 2 или максимум 3, с цел да се намали вероятността от рискова многоплодна бременност.

За да бъде успешно имплантирането, маточната лигавица трябва да е подготвена да ги приеме. По тази причина прехвърлянето на ембрионите трябва да се извърши в рамките на много тесен времеви период /т.нар. имплантационен прозорец/. От няколко дни до 2 седмици преди трансфера пациентката се подлага на терапия с високи дози прогестерон с цел по-добро имплантиране на ембрионите и по-висок шанс за бременност. Определеният брой ембриони, получили най-висока оценка при подбора, се прехвърлят в матката на пациентката през тънък пластмасов катетър, който преминава през маточната шийка (цервикалния канал). Процедурата отнема само няколко минути и е безболезнена, поради което не се налага анестезия.

Успеваемост

Процентът на успеваемост зависи от множество фактори, сред които възрастта и физическото състояние на пациентката, квалификацията и уменията на лекарите, технологичното ниво на оборудването на клиниката и лабораторията. В България процентът на успеваемост е в рамките на 20 до 30%. С гордост отчитаме, че от самото създаване на ин витро център „Селена“ нашият процент не е спадал под 50.

Замразяване

Ако след трансфера има останали доброкачествени зародиши, по желание на двойката те могат да бъдат замразени и използвани при следващ опит. Сперматозоиди и неоплодени яйцеклетки също могат да бъдат замразявани. Този вариант се използва при химиотерапия или при хирургично отстраняване на отделни части или на целите яйчници и тестиси и цели да осигури на двойката възможност за забременяване в бъдеще.

ICSI

Какво представлява методът ICSI?

ICSI методът е подобен на класическото ин витро, при което гаметите (яйцеклетка и сперматозоид) се събират от двамата партньори. Разликата между двете процедури е начинът, по който се извършва оплождането.
При класическото ин витро яйцеклетките и сперматозоидите са смесени в петри и сперматозоидите оплождат яйцеклетките „естествено“. За да има шанс обаче това да се случи, са необходими голям брой бързо подвижни нормални сперматозоиди.
За много двойки броят на подходящите сперматозоиди може да бъде ограничен или могат да съществуват други фактори, възпрепятстващи оплождането. При тези двойки ICSI процедурата дава по-големи шансове.
ICSI е лабораторна процедура, при която един единствен сперматозоид е избран и инжектиран с фина стъклена пипета директно в цитоплазмата на яйцеклетката.
Методът ICSI дава възможност при много малък брой сперматозоиди и неспособността им да проникнат в яйцеклетката по естествен път да се осъществи оплождане.

За кого е подходящ методът ICSI?

От гледна точка на пациентите стимулацията за ICSI е същата, като тази при класическото ин витро.
Обстоятелствата, при които ICSI е подходящо, са:
• намален брой сперматозоиди или тяхната липса (в случая е възможно използването на донор);
• висок процент на сперматозоидите с лоша морфология;
• ниска подвижност на сперматозоидите;
• когато сперматозоидите са получени по хирургичен път от епидидимиса (MESA/PESA), от тестисите (TESE/TESA) или от урината при ретроградна еякулация;
• високо ниво на антитела в семенната течност;
• предишни неуспешни опити при класическото ин витро.

Какво включва ICSI?

• стимулация на яйчниците за подпомагане развитието и узряването на яйцеклетките;
• аспириране на яйцеклетки;
• оплождане на яйцеклетки и култивиране на ембриони;
• трансфер на ембриони.

PESA/TESE

PESА

Този метод представлява подкожно аспириране на сперматозоиди от епидидимиса (депо, в което се събират зрелите сперматозоиди) или директно от тестиса.

Прилага се при:

• запушване на семепроводите (обструктивна азооспермия);
• след вазектомия (хирургична процедура, при която се прекъсва семепровода с цел стерилизиране на мъжа);
• липса на семепровод – вродена или при наличие на травма;
• оперативна интервенция;
• инфекция;
• липса на еякулация при диабет или увреждане на гръбначния мозък.

Аспирираните по този начин сперматозоиди се замразяват и съхраняват за АРТ процедури или поради предстояща вазектомия.

Епидидимната аспирация е най-подходяща, когато производството на сперматозоиди в тестисите е нормално. Процедура се извършва под местна анестезия, като възстановителният период след тази процедура е около 24 часа.

TESE

Тестикуларна екстракция на сперматозоиди (TESE) е процес на отделяне на малка част от тъканта на тестиса под местна упойка. Целта на тази манипулация е извличане на жизнеспособни сперматозоиди, които да се използват при метода интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоиди (ICSI). Процедурата се препоръчва за мъже със азооспермия, причинена от първична тестикуларна недостатъчност или вродена липса на семепровод.

TESE се прилага се в случай на:

• липса на сперматозоиди след PESA;
• необструктивна азооспермия.

Криопрезервация

Криопрезервацията представлява съхранение на клетки или тъкани при ниска температура. Съхранението на сперматозоиди, яйцеклетки и ембриони е неразделна част от АРТ, като приложението им се увеличава постоянно. В някои случаи то е препоръчително, докато в други е с ключово значение за резултата от АРТ. Съхранението на сперматозоиди, яйцеклетки и ембриони започва с тяхното замразяване. За целта към тях се добавят специални вещества (криопротектори), които ги предпазват от увреждане при ниските температури. Съхранението се осъществява, когато те се поставят в течен азот, чиято температура е -196 градуса. От важно значение е фактът, че преживяемостта не зависи от периода на съхранение, т. е. – ако съхранението е правилно извършено, няма значение дали то ще трае дни, месеци или години.

Асистиран хетчинг с лазер

Какво представлява Асистираният хетчинг?

Асистираният хетчинг е лабораторна техника, която се извършва преди ембриотрансфера.

Първите 3 до 6 дни от развитието си ембрионът е обграден и защитен от външна обвивка нар. zona pellucida. При нормални обстоятелства, когато ембрионът достигне матката, тази зона частично се разтваря и ембрионът се „излюпва“, позволявайки имплантацията му.
При някои пациентки се предполага, че стерилитетът може да е причинен от удебелена зона, което прави трудно „излюпването“ и имплантирането на ембриона. Тогава се използва асистираният хетчинг.

Той не крие никакъв риск за ембриона и неговата цялост!

Какво включва Асистираният хетчинг?

Извършва се в ембриологична лаборатория от опитен ембриолог. С помощта на лазер се:

• изтънява зоната
• пробива зоната

Асистираният хетчинг се препоръчва при следните обстоятелства:

• когато пациентката е по-възрастна от 35 г.
• при двойки, които имат предходни неуспешни опити
• при ембриони с удебелена зона /по преценка на ембриолога/
• при замразени ембриони

PGD/PGS

PGD е най-ранното налично пренатално изследване. То се прилага при осъществяването на ICSI процедури, като диагностицирането на ембрионите с неправилен генетичен код се извършва преди връщанетно им в маточното тяло. Прилага се и при двойки, които са носители или са изложени на висок риск от предаване на генетично заболяване на децата си. След диагностицирането, само ембриони, селектирани като незасегнати, се трансферират в матката на жената. PGD може да се прилага с цел повишаване индекса на имплантация на ембрионите и съответно увеличаване шанса за бременност и раждане на здраво дете. След аспириране на яйцеклетките и оплождането им с помощта на лазерна техника се прави биопсия на тридневен ембрион. На този етап от развитието на ембриона всички клетки са еквивалентни и отстраняването на една от тях не води до отклонения в нормалното му развитие. Биопсията на тридневен ембрион дава възможност за получаване на резултати от генетичния анализ до времето на трансфера. При настъпване на бремeнност се прави задължително амниоцентеза или друга пренатална диагностика на плода за потвърждаване на диагнозата от PGD.

Показанията за извършване на PGD са следните:

• Носителство на хромозномни промени;
• Два или повече спонтанни аборта;
• Две или повече неуспешни IVF процедури;
• Мъже с абнормален сперматозоиден анализ;
• Неизяснен стерилитет;
• Напреднала възраст на майката;
• Родено дете с хромозомно нарушение.

Предимства на PGD:

• Селекция и ембриотрансфер на ембриони без хромозомни аномалии;
• Намаляване риска от спонтанни аборти;
• Редукция на многоплодни бременности;
• Повишаване на степента на имплантация;
• Повишаване процента на родени здрави деца.

PGS

PGS позволява раннно диагностициране на хромозомни аномалии както в случаите на допълнителна, така и при липсваща хромозома в кариотипа на ембриона, при транслокации /пренареждане/ и други абнормални форми.

Всеки нормален ембрион има кариотип, съдържащ 46 хромозоми. Половината от тях произхождат от яйцеклетката, а останалите 23 – от сперматозиода. Така ембрионът, съдържащ 46 нормални хромозоми се нарича еуплоиден ембрион. Тези 46 хромозоми са обект на скрининговото изследване PGS.

Анеуплоидията е най-разпространената хромозомна аномалия и представлява наличие на допълнителна хромозома /тризомия/ или липса на хромозома /монозомия/. Когато има допълнителни или липсващи хромозоми, вероятността за имплантация намалява, а се увеличава процентът на спонтанните аборти, както и вероятността за раждане на увреден плод.
Предимплантационните генетични изследвани PGS и PGD са предназначени за ранното откриване на заболявания на ембрионите. Ембриолозите и специалистите по медицинска генетика ще препоръчат най-подходящия метод на биопсия и анализ, в зависимост от индивидуалния случай на всеки пациент.

Магнитно активирано клетъчно сортиране (MACS)

Метод на разделяне на спермални клетки

Методът се основава на магнитно натоварени молекули, свързани със специфични протеини, които се прикрепят върху апоптични (увредени сперматозоиди). При прилагане на магнитно поле апоптотичните сперматозоиди се разделят спрямо нормалните. Апоптотичните сперматозоиди са клетки с увредена /фрагментирана/ ДНК.

Причинители на апоптоза:

• Увреждане на ДНК – йонизираща радиация, токсини;
• Хормони, растежни фактори, цитокини;
• Вирусна или бактериална инфекция;
• Стрес – напр. гладуване; недостиг на растежни фактори, heat-shock, кислородни радикали (пероксид), церамиди;
• Клетки на имунната система.

Предимства на MACS

За разлика от рутинните методи за обработка на сперматозоидите, основаващи се на спермална концентрация и подвижност, MACS действа на молекулно ниво. Това е уникален метод, допълващ конвенционалните методи за обработка на сперматозоиди. Сепарирането чрез MACS допринася за повишаване на процента на подвижните сперматозоиди. Използва се при АРТ процедурите:

• IVF – ICSI процедура;
• инсеминация;
• криоконсервация на сперматозоиди с цел – повишаване качеството им след размразяване.

Ко-култивиране на ембриони с ендометриални клетки

Ко-култивирането с ендометриална тъкан е допълнителна IVF техника, използвана за увеличaване шанса за нормалното развитие на ембрионите и повишаване възможността за безпроблемна бременност. Ко-култивирането е процес, при който ембрионите се развиват в среда, съдържаща клетки от майчината ендометриална тъкан преди да бъдат трансферирани.
Ко-култивирането на ендометриална тъкан е ефективно допълнение към IVF техниките при определени случаи, включително при пациентки, които имат редица неуспешни опити или лошо качество на ембрионите.

След съгласието на пациентката за ендометриална биопсия, като част от IVF цикъл, лекарят взима малка проба от ендометриума точно преди менструалния цикъл, предхождащ IVF-цикъла.Това допълнително стимулира развитието на лигавицата на матката, като по този начин се увеличава възможността за имплантация на ембрионите.
Ендометриалната проба, взета от лекаря, се култивира в ембриологичната лаборатория. След обработка и отглеждане на клетките с цел достигане необходимото количество се замразяват и се съхраняват на -196 C в течен азот. При размразяване преди пункцията отново се култивират в петри, в което ще се отглеждат ембрионите. По този начин ембрионите получават допълнителни хранителни вещества, които подпомагат тяхното нормално развитие.

Ко-култивиране на ембриони с кумулусни клетки

Кумулусните клетки са клетки, обграждащи яйцеклетката. Те я снабдяват с хранителни вещества и растежни фактори и я предпазват по време на придвижването ѝ от яйчниците до матката.

При ИКСИ кумулусните клетки се премахват, за да се установи стадият на узряване на яйцеклетката.
При ко-култивирането кумулусните клетки се инкубират в хранителна среда, за да се размножат. Ембрионите, поставени в такава среда, получават допълнителни хранителни вещества и растежни фактори важни за тяхното развитие.
Използването на този метод допълнително допринася за по-доброто качество на ембрионите и запазването им в една среда максимално близка до тяхната естествена.

Вътрематочна/интраутеринна инсеминация – IUI

Вътрематочната инсеминация /IUI/, наричана още „изкуствено осеменяване“, е минимално инвазивна, безболезнена процедура, прилагана при лечение на стерилитет. Чрез вътрематочната инсеминация се внася обработена семенна течност в маточната кухина на жената с помощта на специален интраутеринен катетър под УЗ контрол. Процедурата допринася за увеличаване броя на качествените сперматозоиди, съкращавайки времето и пътя на тяхното придвижване до фалопиевите тръби, където се осъществява оплождането.

Необходими изследвания за вътрематочната инсеминация

1. При жената:

• Серологични изследвания: HIV, Васерман, хепатит B, хепатит C, хламидия;
• Микробиологични изследвания: влагалищен секрет.

2. При мъжа:

• Серологични изследвания: HIV, Васерман, хепатит B, хепатит C, хламидия;
• Микробиология на еякулат.

Всички изследвания трябва да са валидни към датата на процедурата.

Вътрематочна инсеминация може да се осъществи:

• На естествен цикъл, без стимулация с хормонални препарати – развива се един доминантен фоликул, който се проследява чрез ултразвуково изследване и хормонално проследяване на нивата на естрадиола (Е2) и лутеинизиращия хормон (ЛХ);
• На стимулиран цикъл – стимулация с гонадотропни препарати с цел да се развие повече от един фоликул.

Вътрематочните инсеминации могат да бъдат:

1.Със съпружески/партньорски материал, отделен в деня на инсеминацията или предварително замразен.

2.С донорски материал – използва се замразен материал, предоставен от Донорска криобанка на УСБАЛАГ „Селена“. Донорите са подбрани според качеството на спермалните проби, след изследвания за полово предавани и инфекциозни болести, кръвна група, генетични болести, общ физиологичен статус, външни белези, образование и т. н. преди да бъдат одобрени в дарителската програма и по Наредба № 28.

Вътрематочната инсеминация се прилага при:

• Неизяснен стерилитет с опити за бременност без резултат;
• Занижени показатели на семенния материал – олигозооспермия, астенозооспермия, тератозооспермия или комбинация от тях;
• Враждебна среда във влагалището или лош цервикалeн секрет;
• Проблеми с шийката на матката, затрудняващи навлизането на спермата в матката;
• Еректилна дисфункция;
• Наличие на антиспермални антитела;
• Овулаторни нарушения.

Вътрематочната инсеминация не се препоръчва при пациенти със следните проблеми:

• жени с тежки заболявания на фалопиевите тръби;
• с тазови инфекции;
• със средна до тежка ендометриоза.

Успеваемостта на процедурата достига до 15-20% и зависи от редица фактори, сред които: възрастта на жената, причината за инфертилитет, лекарствените средства, използвани при стимулацията и други.